油甘子的根功效与作用

余甘子根枝叶美白作用的探究实验报告20111018
油甘子的根功效与作用(一)

余甘子根枝叶对酪氨酸酶活性的影响研究

参加人：陈俊盛，冉正花，李朝丰 复核：

【摘要】目的：研究余甘子鲜果、干果以及余甘子根、枝、叶各部分提取物的美白效果。方法： 以维生素C为对照，应用紫外分光光度法建立酪氨酸酶催化多巴转换成黑色素的体外模型，测定不同浓度余甘子鲜果、干果及余甘子根、枝、叶各部分提取物对酪氨酸酶活性的影响。结果： 实验表明Vc、余甘子鲜果、干果以及余甘子根、枝、叶对络氨酸酶均有抑制作用，其EC50分别为0.12、5.84、9.27、16.31、14.99、12.44 mg/ml； 结论： 余甘子鲜果、干果以及余甘子根、枝、叶均对酪氨酸酶活性有不同程度的抑制作用，且作用效果：余甘子鲜果>余甘子干果>余甘子根>余甘子枝>余甘子叶。 【关键词】 酪氨酸酶；余甘子；紫外分光光度法

黑色素的形成是酪氨酸酶在机体内将L-酪氨酸羟化，产生邻位二羟基苯丙氨酸(L-多巴)，再将多巴氧化成多醌，进而生成一系列引起褐化的色素类物质[1]，最终导致人的皮肤变黑或是黄褐斑，雀斑。而植物美白一直是化妆品研究的一个重要方向，余甘子除了含有矿物质、微量元素、类胡萝卜素之外，还含有丰富的各类型果糖，八种自由氨基酸、消炎成分-鞣剂，以及丰富的维生素C等。本实验通过研究余甘子不同部位的乙醇提取物对酪氨酸酶的影响程度，来评价余甘子不同部位有无美白作用。 1 材料 1.1仪器

Thermo Heλios-r紫外—可见光分光光度计(赛默飞世尔科技（上海）有限公司， Thermo Fisher)，电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司，BS110S），循环水式真空泵抽滤机（巩义市予华仪器有限公司，SHZ-D(Ⅲ)），飞鸽牌离心机（上海安亭科学仪器厂，Anhe TDL-5-A），旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂， RE-52A），水浴锅（巩义市予华仪器有限公司，HH-S水浴锅）及实验室常用实验仪器。 1.2试剂

余甘子鲜果、余甘子干果、余甘子根、枝、叶（采自广东汕头雷岭镇，广东荔宝酿酒有限公司提供），乙醇（分析纯，天津市百世化工有限公司，批号：20100426），L-多巴（sigma），酪氨酸酶（sigma），磷酸二氢钠（分析纯，天津市百世化工有限公司，批号:20090920），氢氧化钠（分析纯，天津市福晨化学试剂厂，批号：20091012），磷酸二氢钾（分析纯，天津市大茂化学试剂厂批

号:20090815）。【油甘子的根功效与作用】

2 方法

2.1样品的制备

2.1.1 余甘子鲜果溶液的制备

取去核余甘子鲜果3g，用150ml的50%的乙醇回流2h，浓缩到80ml； 精密量取5ml浓缩液至10ml容量瓶，定容至刻度，得2倍稀释液；精密量取2ml浓缩液至10ml容量瓶，定容至刻度，得5倍稀释液；精密量取浓缩液4ml浓缩液至25ml容量瓶，定容至刻度，得4/25倍稀释液；备用。 2.1.2 余甘子干果溶液的制备

取去核余甘子干果2g，用150ml的50%的乙醇回流2h，浓缩到80ml； 精密量取5ml浓缩液至10ml容量瓶，用50%的乙醇定容至刻度，得2倍稀释液；精密量取2倍稀释液，5ml浓缩液至10ml容量瓶，用50%的乙醇定容至刻度，得4倍稀释液；精密量取浓缩液1ml浓缩液至10ml容量瓶，用50%的乙醇定容至刻度，得10倍稀释液；备用。 2.1.3余甘子根、枝、叶溶液的制备

分别取余甘子根枝叶粉末5g，用35ml的50%乙醇回流1h，再加等量的50%乙醇回流1h,过滤，浓缩到40ml；用50%的乙醇稀释2倍，5倍，8倍，10倍，20倍，得到就不同浓度的样品溶液，备用 2.1.4酪氨酸酶的提取

去皮碎土豆60g (冷冻过夜),按2:1（W/V）加入PH=7.2的缓冲溶液30ml，捣碎制成匀浆，4000r/min下离心10min，取上层清夜置于冰箱中。取25ml酶提取液，用PH=7.2的缓冲稀释至100ml管中，摇均冷藏备用。 2.1.5 Vc样品的制备

精密称量0.1027g Vc样品，用少量的50%的乙醇溶解，移至10ml的容量瓶，定容至刻度，精密量取1ml上述溶液至10ml容量瓶，定容至刻度，得10倍稀释液，同样的方法制备50倍，100倍，1000倍稀释液，备用。 2.2溶液配制

2.2.1 0.10mol/L缓冲溶液（PH=7.2）制备

精密量取25 ml 0．20 mol／L Na2HPO4和10 ml 0．1 mol／L HC1至100 ml

容量瓶， 定容至刻度，备用。

2.2.2 0.10mol/L缓冲溶液（PH=6.0）制备

精密量取50 ml 0．20 mol／LNa2HPO4和9 ml 0．1 mol／L HC1至200 ml容量瓶，定容至刻度，备用

2.2.3 0.005mol／L多巴溶液制备

准确称取0．0996g多巴，用蒸馏水溶解并定容至100 ml容量瓶中。将配好的溶液置于黑暗处避光存放，冷藏备用。 2.3样品对酪氨酸酶作用的测定方法[2]

用安瓿瓶按下表1配制余甘子鲜果，干果稀释好的4种不同浓度溶液的待测浓度；配制余甘子根、枝、叶，维生素C稀释好的5种不同浓度溶液的待测溶液，置30℃水浴3 min后，加入2 ml酶液，再置30℃水浴，恒温25 min后，在波长480 nm处测定不同浓度的A值。

表1 测试液的配比表

样品 水 PBS L-多巴

2.4 标准曲线的绘制

对酪氨酸酶活性的影响：以空白管调0，分别测定表1中A1、A2。 若A1>A2，则样品对酪氨酸酶活性有抑制作用，抑制率(I％)= (A1-A2)／A1×100%；若A1<A2，则样品对酪氨酸酶活性有激活作用，激活率(E％)= (A2-A1)／Al×100%；A1：未加样品时所测得的吸光度值；A2：加入样品后所测得的吸光度值。

计算个样品抑制率(或激活率）,以浓度对数-抑制率（激活率）做标准曲线，得回归方程并求得50%的抑制浓度（IC50） 3 结果

3.1 按“2.4”项下的公式计算抑制率，结果见表2

表2各种样品对酪氨酸酶的抑制作用

空白1 - 3 5 -

测定A1

- 1 5 2

空白2 1 2 5 -

测定A2 1 - 5 2【油甘子的根功效与作用】【油甘子的根功效与作用】

样品

编号 1 2 3 4 5 1 2 3 4 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 1 2 3 4

浓度吸光度mg/ml lgC 1 0.01 -2.00 0.85 0.11 -0.96 0.85 0.22 -0.66 0.85 1.08 0.03 0.85 10.78 1.03 0.85 5.00 0.70 0.85 12.50 1.10 0.85 20.00 1.30 0.85 50.00 1.70 0.85 5.00 0.70 0.85 10.00 1.00 0.85 12.50 1.10 0.85 20.00 1.30 0.85 50.00 1.70 0.85 5.00 0.70 0.85 10.00 1.00 0.85 12.50 1.10 0.85 20.00 1.30 0.85 50.00 1.70 0.85 6 0.78 0.85 9.375 0.97 0.85 18.75 1.27 0.85 37.5 1.57 0.85 2.5 0.40 0.85 6.25 0.80 0.85 12.5 1.10 0.85 25 1.40 0.85

吸光度

2 0.58 0.47 0.35 0.32 0.12 0.58 0.46 0.31 0.20 0.61 0.50 0.50 0.31 0.24 0.61 0.57 0.50 0.36 0.22 0.44 0.35 0.22 0.17 0.55 0.48 0.43 0.29

抑制率线性范围相关系(%) (mg/ml) 数 32.08 44.96

59.02 0.01~10.78 0.94 62.53 85.95 31.73 46.72

5~50 0.97

64.17 76.81 28.22 40.98 41.92 5~50 0.94 63.23 71.78 28.69 33.61 41.33 5~50 0.95 58.20 74.71 48.65 58.97

6~37.5 0.96

74.33 80.54 35.52 44.20

2.5~25 0.93

49.36 65.77

维生素C

余甘子叶

余甘子枝

余甘子根

鲜余甘子

干余甘子

3.2 以抑制率做纵坐标，浓度对数为横坐标作图(如图1)，得回归方程及线性范围，并计算各样品的50%抑制浓度（IC50），结果如表3

图1 不同样品的不同浓度对酪氨酸酶作用的比较

样品 维生素C 余甘子叶 余甘子枝 余甘子根

线性关系

y = 17.563x + 65.866 y = 46.698x - 1.1296 y = 46.326x - 4.4725 y = 49.694x - 10.298

线性范围（mg/ml）

5~50

5~50 5~50 5~50 6~37.5 2.5~25

IC50 （mg/ml）

0.12 12.44 14.99 16.31 5.8 9.2

鲜余甘子

干余甘子

y = 40.809x + 18.721

y = 28.656x + 22.345

))))))

表3

由以上数据可以表明，余甘子鲜果、余甘子干果、余甘子根、枝、叶提取物的实验结果均表现为A1>A2,说明余甘子的不同部位对酪氨酸酶均有不同程度的抑制作用，都有良好的美白效果，余甘子根、枝、叶的效果显著；余甘子鲜果>余甘子干果>余甘子根>余甘子枝>余甘子叶。 4 讨论

4.1酪氨酸酶在黑素产生的过程中饰演了重要的角色。酪氨酸酶活性增加，产生的黑素就会更多；活性被抑制，黑素细胞产生黑素的能力就相应降低。目前市场上美白药物主要是通过抑制酪氨酸酶活性，从而抑制黑素的形成，达到美白之功效。

4.2 实验结果证明，通过VC阳性对照证明余甘子不同部分对酪氨酸酶均有一定的抑制作用，也间接说明余甘子在美白化妆品领域有潜在的应用价值，但它的有效成分尚需进一步研究。

4.3 L-多巴见光易分解，需避光。

4.4 试剂要现配现用，试验的条件的选择应该充分考虑好PH的选侧（偏酸性）。

4.5 本实验是属于酶促反应，所以应该严格反应控制时间，加入酶后水浴25min立即测紫外。

4.6 本实验应采用水浴控制温度在30℃左右，试验结果发现在30℃酶有最大的催化活性，而且在30℃时试验的重现性最好。